甲氨蝶呤是一种常用的抗代谢类化疗药物，在多种疾病的治疗中发挥作用。例如在风湿免疫性疾病的治疗中，约70% - 80%的类风湿关节炎患者使用甲氨蝶呤后病情能得到一定控制。
用于风湿免疫性疾病
类风湿关节炎： 甲氨蝶呤能抑制细胞内二氢叶酸还原酶，使嘌呤合成受抑，从而起到抗炎、减轻关节肿胀疼痛等作用，可延缓关节破坏。一般需要持续使用一段时间才能见到较好效果。银屑病关节炎： 对于银屑病关节炎患者，甲氨蝶呤可改善关节症状，同时对皮肤的银屑病皮疹也有一定缓解作用，能减少皮疹的面积和严重程度。
用于血液系统疾病
急性淋巴细胞白血病： 在儿童急性淋巴细胞白血病的诱导缓解治疗等阶段，甲氨蝶呤常被应用，可参与化疗方案，抑制白血病细胞的增殖。淋巴瘤： 对于一些类型的淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤等，甲氨蝶呤也是化疗方案中的重要药物之一，通过抑制肿瘤细胞的核酸合成来发挥抗肿瘤作用。
用于肿瘤疾病
骨肉瘤： 在骨肉瘤的治疗中，甲氨蝶呤可与其他化疗药物联合使用，帮助控制肿瘤细胞的生长和扩散，提高治疗效果。头颈部肿瘤： 对于头颈部的一些肿瘤，甲氨蝶呤也可能被用于辅助治疗，抑制肿瘤细胞的代谢过程，从而限制肿瘤的发展。