阿托品的作用机理主要是通过阻断乙酰胆碱与M胆碱受体的结合来发挥作用。乙酰胆碱能兴奋M胆碱受体，而阿托品与之竞争受体，从而产生多方面的影响。
对平滑肌的作用
胃肠道平滑肌： 能松弛胃肠道平滑肌，降低其蠕动的频率和幅度。比如在胃肠道痉挛导致疼痛时，阿托品可以缓解这种痉挛状态，减轻疼痛。胆道平滑肌： 也能对胆道平滑肌产生一定的松弛作用，但相对胃肠道平滑肌作用较弱。
对腺体的作用
唾液腺和汗腺： 能抑制唾液腺和汗腺的分泌。较大剂量的阿托品可使唾液分泌显著减少，引起口干；也能减少汗腺分泌，导致皮肤干燥等。例如在一些麻醉前用药中，使用阿托品就是为了减少呼吸道分泌物和唾液分泌。呼吸道腺体： 能抑制呼吸道腺体的分泌，使痰液变稠，不利于痰液排出，所以在呼吸道有大量分泌物时要谨慎使用。
对心血管系统的作用
心脏： 小剂量的阿托品可使部分患者心率短暂性轻度减慢，这是因为阿托品阻断了迷走神经对心脏的抑制作用；较大剂量的阿托品则可加快心率，这是因为阻断了迷走神经对窦房结的抑制。它还能对抗迷走神经过度兴奋所致的房室传导阻滞和心律失常等。血管： 一般治疗量的阿托品对血管和血压影响不大，但大剂量的阿托品能解除血管痉挛，尤其是对皮肤血管的扩张作用较为明显，可引起皮肤潮红温热等。不过这种作用机制相对复杂，与直接的M胆碱受体阻断不一定完全直接相关，还可能与机体的代偿机制等有关。