青霉素钾属于β-内酰胺类抗生素，主要通过干扰细菌细胞壁的合成发挥抗菌作用。其对多种细菌具有抗菌活性，例如：
革兰阳性菌：对溶血性链球菌、肺炎链球菌、不产青霉素酶的金黄色葡萄球菌等有良好抗菌作用。溶血性链球菌引起的扁桃体炎、猩红热等疾病，青霉素钾可发挥抗菌治疗作用；肺炎链球菌导致的肺炎，青霉素钾也能起到杀菌清除病原体的作用。
革兰阴性菌：对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等革兰阴性球菌有一定抗菌作用，可用于治疗脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑脊髓膜炎等疾病。
螺旋体：对梅毒螺旋体、回归热螺旋体等螺旋体有较好抗菌效果，是梅毒等螺旋体感染性疾病的首选药物。
对于特殊人群：
儿童：儿童使用青霉素钾时需谨慎，要根据体重等情况合理用药，因为儿童的肝肾功能发育尚未完全成熟，药物代谢和排泄与成人不同，使用不当可能影响肝肾功能，且儿童使用过程中要密切观察是否出现过敏等不良反应。
老年人：老年人肝肾功能有所减退，使用青霉素钾时也需要监测肾功能等指标，根据情况调整用药，因为其药物清除率可能下降，容易导致药物在体内蓄积。
过敏体质者：有青霉素类药物过敏史的人群禁止使用青霉素钾，使用前必须详细询问过敏史，因为过敏体质者发生过敏反应的风险较高，可能出现严重的过敏症状如过敏性休克等，危及生命。